高效液相色譜法(HPLC)是目前應用廣泛的分離、分析、純化有機化合物(包括能通過化學反應轉變為有機化合物的無機物)的有效方法之一，在使用高效液相色譜儀的過程中,難免會碰到各種各樣的問題,如果使用人員了解常見問題及其原因和相關解決辦法，就能做到勤維護、早預防。使分析結果保持較好的穩定性和較高的準確度。
HPLC常見故障排除原則
色譜雙峰產生的可能及判斷和處理
HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應對稱而尖銳。但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此。 色譜雙峰指的是明是一種物質，但在色譜圖中出現雙峰，而表明含二種物質。出現這種情況分為四種原因。
1、色譜柱
如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現 （出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當然不反沖，正沖有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術，同時不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應柱效很低而報廢。
2、溶劑極性及進樣量
許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的 HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內容，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前HPLC分析 多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當用溶劑極性強度大的試劑，如 純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變為正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。
3、樣品的特性
有些樣品由于其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質將出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農藥啶蟲瞇（吡蟲清）。
4、參數
記錄的參數一般都內定的，不必修改，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如C－R3A數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變為二個峰或更多。
為什么在實驗過程中有時會出現倒峰？
所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進在此波長下沒有吸收或吸收低于流動相的溶液，在流動相中會出現洞穴，通過柱后出現倒峰。
為何會出現“胖”峰和平頭峰？怎樣避免？
用比流動相強度大的大體積樣品進樣，通常會損害色譜圖的質量，而出現“胖”峰和平頭峰。應遵循下列規則選用溶劑溶解樣品：A最好用流動相溶解樣品進樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進樣，主要缺點是每次進樣后在色譜圖的開頭出現大的負峰，有時還波及到樣品峰。C需要時用強溶劑溶解進樣。
前延峰的發生及處理？
因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下 分離可見前延峰，提高溫度后前延峰的現象消失。在離子對色譜中，前延峰的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進樣量不要太大，否則會導致前延峰或其它問題。在RP-HPLC中樣品溶液的強度大于流動相引起前延峰。增加流動相的強度，減少樣品溶液的強 度，在離子對色譜中增加離子強度，可以克服前延峰的效應。此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單實用的方法。
如何簡單判斷比例閥是否內漏？
設定泵使用一個單獨通路（A），打開Purge閥，流速5ml/min，提起其他溶劑瓶內的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路（B、C、D）內的溶劑是否隨著流動，正常時均不應流動。
峰變寬的原因？
A在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效。B柱外峰寬效應。一根很好的專用柱用于另一液相色譜系統引起塔板數降低，說明新系統有很大的柱外峰寬效應。C化學效應，多數是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峰有所改善。
柱平衡慢的常見原因有哪些？
柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強，或者在新的流動相中濃度小甚至為 零。A流動相含有胺改良劑；B流動相含有離子對試劑；硅膠柱；流動相中有四氫呋喃。可考慮采用專用柱用于特殊的方法，不用時將柱折下來，注滿適當的溶劑或流動相，密封保管，不再作其它的分析。
對內標物的要求有哪些？
A內標物的結構或理化性質應與被分析組分相 似或相近；B內標物的保留值應稍大于或小于被分析物的保留，不能相差過大；C內標物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度（R大于1.5），不能讓內標物成了干擾物；D無結構相似的內標物，可用保留相近的內標物；E儀器對分析物的響應與內標基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。
什么是HPLC的“無限直徑效應”？
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內壁接觸，因而引起的色譜峰形擴展很小，能保持高柱效。
如何評價一臺檢測器？
A噪聲：通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈沖以及其他非溶質作用產生的高頻噪聲和基線的無規則波動；
B基線飄移：漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間（0.5~1h）內觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統有關，而不僅是由檢測器引起的；
C靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）：在一個特定分離工作中， 檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標。敏感度即指信號與噪聲的比值（信噪比）等于2時，在單位時間內進入檢測器的溶質的濃度或質量；
D線性范圍：在進行定量分析時，希望檢測器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進行檢測； E檢測器的池體積：它應小于最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產生嚴重的柱外譜帶擴展。
（本文由實驗與分析編輯整理，轉載請注明出處）
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