本文主要針對目前申報的無菌制劑工藝中存在的問題，調(diào)研了有關(guān)的文獻資料，較詳細地介紹了無菌制劑的滅菌工藝和滅菌工藝的驗證方法，目的是提請注冊申請人根據(jù)研制產(chǎn)品的劑型特點、微生物的情況和主成分的性質(zhì)，選擇合適的滅菌方法，并對滅菌工藝進行驗證，以確保產(chǎn)品達到無菌要求。關(guān)鍵詞：無菌制劑，滅菌方法，滅菌工藝的驗證。
無菌制劑應具有無菌、無微生物污染的特性。無菌制劑主要包括注射劑、眼用制劑、植入劑、用于傷口或手術(shù)后切口的沖洗液和透析液等。因為它們直接與身體內(nèi)易發(fā)生感染的體液或組織接觸，故這些制劑中無菌是最重要的質(zhì)量指標。
無菌制劑的制備工藝過程中最重要的步驟就是滅菌。全部地殺滅或除去細菌，通常稱為滅菌。常用的滅菌方法主要有以下5種：1、蒸汽法；2、干熱法；3、過濾法；4、環(huán)氧乙烷法；5、輻射法。選擇哪種方法進行滅菌，主要考慮制劑的特點、微生物的情況和主成分的性質(zhì)（化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等），但不管采用哪種方法，產(chǎn)品必須要經(jīng)過無菌檢查以證明所采用方法的效果，同時還要對滅菌方法進行驗證。
筆者在審評過程中發(fā)現(xiàn)，個別無菌制劑申報資料中制備工藝部分選擇滅菌方法比較隨意，沒有考慮制劑的特點、微生物的情況和主成分的性質(zhì)。例如，對耐熱的注射液，在沒有考察主輔料中存在的微生物的情況下，直接選擇過濾滅菌法。另外，濕熱滅菌溫度的確定僅依據(jù)主藥的穩(wěn)定性，未考慮劑型選擇的合理性和滅菌的效果，這種現(xiàn)象在粉針改小水針、小水針改大輸液中比較明顯。實際上，劑型的選擇、制備工藝的研究和驗證，以及擬達到的制劑的質(zhì)量指標之間是相互關(guān)聯(lián)的，如果不能達到擬定的制劑的質(zhì)量指標，則應該考慮劑型選擇的合理性和制備工藝的可行性。下面就常用的滅菌方法和如何進行滅菌工藝的驗證做一簡要的介紹，目的是與有關(guān)同仁進行交流和探討，共同提高對滅菌方法和滅菌驗證工作的認識。
1、蒸汽法：是在高壓滅菌器中使用高壓蒸汽進行滅菌的方法。因微生物在濕熱的環(huán)境中，一些重要的蛋白發(fā)生變性和凝固，使微生物死亡，從而達到滅菌的目的。較之干熱滅菌，在濕熱的條件下，微生物可在相對較低的溫度下被殺死。高壓滅菌器的常規(guī)操作溫度是121℃，時間是20分鐘；也可選擇達到相同殺滅效果的115℃，30分鐘。一般來說，濕熱滅菌方法適用于可承受所需溫度，且能被濕氣穿透但不會受到不良影響的、包裝在密閉容器中的藥物制劑。蒸汽滅菌對油類、脂肪類、油性制劑、其他不能被濕氣穿透的制劑，以及可能會被凝結(jié)水破壞的粉末無效。
2、干熱法：是在特別設(shè)計的滅菌爐中進行滅菌的方法，通過氣體或電加熱，爐內(nèi)溫度可控。干熱滅菌是基于焚化或氧化使微生物脫水死亡，從而達到滅菌的目的。因干熱滅菌在殺滅微生物方面的效果較差，故需要更高的溫度和更長的時間。具體的溫度和時間需根據(jù)制劑的大小和類型、容器及其熱分布特性來確定。一般來說，進行滅菌處理的個體單位應盡量小，裝載滅菌爐時熱空氣應能在爐內(nèi)容器室內(nèi)自由循環(huán)。干熱滅菌的溫度通常是160℃至170℃，時間不少于2小時。更高的溫度可縮短時間，反之，較低的溫度則需要更長的時間。干熱滅菌通常用于濕熱滅菌無效的物質(zhì)，包括不揮發(fā)油、甘油及各種熱穩(wěn)定的粉末等。干熱滅菌也是玻璃器皿和手術(shù)器具滅菌的有效方法。
3、過濾法：是通過過濾介質(zhì)吸附或篩除去除微生物的方法。一般用于熱敏感溶液的滅菌。但是，采用過濾滅菌方法的制劑必須要進行嚴格的無菌檢查和驗證，因為制劑過濾滅菌的有效性主要取決于被濾溶液中存在的微生物。所以要根據(jù)被濾溶液中存在的微生物情況，選擇適宜孔徑的濾膜。
4、環(huán)氧乙烷法：環(huán)氧乙烷（EO C2H4O）是最常用的氣體滅菌劑。其是通過與細胞內(nèi)的大分子起化學反應而破壞和消除蛋白的活性，使微生物死亡，達到滅菌的目的。通常用于熱敏感和濕敏感的物質(zhì)。氣體滅菌的設(shè)備與高壓滅菌的設(shè)備類似，蒸汽高壓滅菌器與環(huán)氧乙烷滅菌器聯(lián)用的裝置已經(jīng)上市。氣體滅菌法的可變因素較多，如溫度（27℃～63℃，通常在38℃～54℃之間）、氣體的濃度（300mg/ml～1200mg/ml，通常在400mg/ml～600mg/ml之間）、濕度（RH30%～90%，通常在RH 50%～60%之間）和時間，故較之蒸汽滅菌法和干熱滅菌法，氣體滅菌法不能嚴格定量。一般來說，增加系統(tǒng)的相對濕度和溫度可以增強氣體滅菌的效果，并可縮短時間。如果被滅菌物質(zhì)不能承受增加的濕度和溫度，則需要延長時間。通常環(huán)氧乙烷氣體滅菌的時間為4至16個小時。因為環(huán)氧乙烷氣體具有較強的穿透能力，常用于醫(yī)療器械、外科手術(shù)用具和一次性塑料注射器等的滅菌；還可用于不與氣體發(fā)生化學反應的不穩(wěn)定的酶制劑、抗生素和其他藥物的滅菌。
5、輻射法：是使用γ射線或陰極射線滅菌的方法?？赡苁腔谕ㄟ^射線照射后，微生物中的化學物質(zhì)（DNA）發(fā)生了變化，使細胞活性喪失，從而達到滅菌的目的。通常劑量 1.5Mrad。輻射滅菌可對某些藥物制劑進行滅菌，但需要非常特殊的設(shè)備，因此在實際的應用過程中受到限制。
上述滅菌方法中應用和研究最廣泛的是加熱法，加熱滅菌是以完全殺滅細菌為特征的手段，也是通常選用的方法。
所有滅菌工藝的驗證都要經(jīng)過以下四個步驟：1、選擇能抵抗滅菌工藝的生物指示劑；2、考察各種變量對生物指示劑耐受性的影響（例如，生物指示劑的繁殖，生物指示劑與被滅菌物質(zhì)之間的相互影響）；3、建立生物指示劑在滅菌過程中破壞的定量指標；4、測定被滅菌物質(zhì)在特定工藝條件下實現(xiàn)無菌的可能性。
生物指示劑應具有如下特性：1、對滅菌方法具有耐受性；2、耐受性在設(shè)定的條件下穩(wěn)定且可重復；3、滅菌工藝后可有效回收；4、非致病性。
實際上，每一種滅菌工藝都經(jīng)過具有上述特征的細菌的驗證，除過濾法外，常規(guī)使用的生物指示劑是孢子，因為在不利的環(huán)境中，孢子比一般細菌的生存能力強。濕熱、干熱、環(huán)氧乙烷和輻射滅菌都用革蘭陽性菌的孢子做生物指示劑，過濾滅菌用革蘭陰性小棒狀桿菌做生物指示劑。
選擇了合適的生物指示劑，滅菌方法的有效性就可以用生物指示劑的去除來表示。
滅菌研究的基本工具就是存活曲線，它是通過繪制存活的生物指示劑的數(shù)量得到，該數(shù)量是設(shè)定滅菌方法的某些參數(shù)的指數(shù)函數(shù)。加熱滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌的存活曲線，生物指示劑的存活數(shù)是在固定滅菌條件下（加熱滅菌是溫度，環(huán)氧乙烷滅菌是氣體、溫度和相對濕度的共同作用）暴露時間的函數(shù)。輻射滅菌的存活曲線，生物指示劑的存活數(shù)是輻射劑量（劑量單位是rad 或Mrad）的函數(shù)。用標準微生物技術(shù)（平板計數(shù)法）定量測定滅菌過程不同時間區(qū)間存活的生物指示劑數(shù)，以時間為橫坐標繪制存活曲線。從存活曲線上可以計算出滅菌耐受性的D值，也就是存活曲線的斜率。D值是將細菌的總量減少一個數(shù)量級所需的時間（加熱滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌）或劑量（輻射滅菌）。
如果D值為2分鐘，要將細菌數(shù)減少6個數(shù)量級，總的暴露時間應為12分鐘。但通常滅菌方法是通過過度殺滅來驗證的（細菌數(shù)減少12個數(shù)量級），故總的暴露時間應為24分鐘。
過濾滅菌法生物指示劑的去除用過濾器的除菌效率（LRV）表示，LRV是在標準的生物指示劑數(shù)量（107個菌/cm2過濾面積）和過濾條件下測定的。
滅菌工藝是保證無菌制劑達到無菌要求的關(guān)鍵步驟，注冊申請人應根據(jù)研制產(chǎn)品的劑型特點、微生物的情況和主成分的性質(zhì)（化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等），選擇合適的滅菌方法，且所選滅菌工藝是經(jīng)過驗證的。如所選滅菌工藝為非常規(guī)滅菌工藝，不僅要經(jīng)過無菌檢查以證明所采用工藝的效果，還應對滅菌工藝進行驗證，以確保產(chǎn)品達到無菌要求。
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