1、 標(biāo)記時(shí)pH對(duì)標(biāo)記的影響
根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)，可以將標(biāo)記物劃分為三類(lèi)。
其一為pH非依賴(lài)型，即標(biāo)記時(shí)無(wú)論pH如何，您都能得到良好的標(biāo)記結(jié)果，前提是您不能破壞膠體金的膠體狀態(tài)。此類(lèi)標(biāo)記物僅僅是通過(guò)疏水相互作用與膠體金相結(jié)合，如P EG.這也是調(diào)節(jié)pH時(shí)首先要采用PEG保護(hù)電極的原因，當(dāng)然，如果您使用的是充膠的電極，那您就不必這樣麻煩了。呵呵，真希望所有的標(biāo)記物都象P EG那樣簡(jiǎn)單。
其二為pH非嚴(yán)格依賴(lài)型，即標(biāo)記時(shí)您可以采用的pH范圍比較寬。此類(lèi)標(biāo)記物的特點(diǎn)是其等電點(diǎn)的范圍很寬。當(dāng)然，其主要是通過(guò)堿性氨基酸殘基的正電性與膠體金的負(fù)電性相吸引，此類(lèi)物質(zhì)典型的如H BsAg.如果您想偷懶的話，制備好膠體金后，您可以直接將HBsAg扔到里面，就能得到良好的標(biāo)記結(jié)果。不偷懶的話，您當(dāng)然可以調(diào)節(jié)pH啦，這樣，標(biāo)記的批間差可能小一些，P H從5到10都可以。呵呵，俺們也很喜歡這樣聽(tīng)話乖巧的東東。
其三為pH嚴(yán)格依賴(lài)型，即最好的標(biāo)記效果是pH=pI+0.5.這樣的東東可是大家最最常見(jiàn)的，再此就不饒舌。
2、 標(biāo)記物與膠體金結(jié)合后的穩(wěn)定性
一般來(lái)說(shuō)，pH非依賴(lài)型&pH非嚴(yán)格依賴(lài)型的東東標(biāo)記后因pH的變化而解離的幾率不是很大，尤其是pH非依賴(lài)型。當(dāng)然前提仍然是您不能讓那些東東處于極其苛刻的p H環(huán)境之下的，還是要愛(ài)護(hù)它們的。
pH嚴(yán)格依賴(lài)型的東東根據(jù)對(duì)環(huán)境pH的變化有可以分成兩類(lèi)，第一類(lèi)是結(jié)合后如果環(huán)境的pH高于其等電點(diǎn)，標(biāo)記物很容易與膠體金解離。如果您再加入鹽，您會(huì)看到膠體金會(huì)變成紫塞- 藍(lán)色。此類(lèi)標(biāo)記物靜電相互作用要大于疏水相互作用，其分子量一般相對(duì)小。
（這也是DOA中為啥不標(biāo)記完全抗原的原因之一）。因此，其膠體金稀釋液的p H要與標(biāo)記時(shí)的一致，其它緩沖體系最好也如此。第二類(lèi)是結(jié)合后如果環(huán)境的pH高于其等電點(diǎn)，標(biāo)記物一般不會(huì)與膠體金解離（啥，您要試試p H 14的？！）。
如果您加入鹽，膠體金仍然能保持一顆紅心不變的。此類(lèi)標(biāo)記物疏水相互作用/配位鍵>靜電斥力，其分子量一般比較大，如抗體。當(dāng)然，緩沖體系就比較好辦了。
3、 標(biāo)記物的量
按照常規(guī)的方法，最低穩(wěn)定量+10-20%是好的，但俺們認(rèn)為您最好做一下功能性實(shí)驗(yàn)（靈敏度，穩(wěn)定性），可能您會(huì)發(fā)現(xiàn)再多加一些蛋白，如抗體，其靈敏度和穩(wěn)定性會(huì)更好一些。這是因?yàn)樵跐舛雀叩那闆r下標(biāo)記，抗體傾向與利用F c片段與膠體金結(jié)合，這樣就有較多Fab片段處于游離狀態(tài)。就如在擁擠的情況下，人也會(huì)盡量將脖子伸的更長(zhǎng)。
4、 標(biāo)記物與膠體金結(jié)合的三個(gè)力
眾所周知，標(biāo)記物是通過(guò)三個(gè)作用力與膠體金相結(jié)合的，一是靜電引力，二是疏水相互作用，三是配位鍵。對(duì)蛋白而言，調(diào)節(jié)標(biāo)記pH的主要目的是使其包含在內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露，而不是刻意使蛋白帶正點(diǎn)荷。
在p H=pI+0.5的條件下，蛋白整體上是呈負(fù)電性的，只是其堿性氨基酸殘基為正電性。
我們認(rèn)為，在最適的標(biāo)記條件下，如果標(biāo)記物的硫原子很少，對(duì)大分子而言，結(jié)合力是以疏水作用為主的；對(duì)小分子而言，結(jié)合力是可能是靜電引力為主，也可能以疏水作用為主的；如果標(biāo)記物的硫原子很多，那肯定的配位鍵是主角，因?yàn)榕湮绘I的作用力最N 了。配位鍵就想一個(gè)聰明而有調(diào)皮的小孩，讓人即愛(ài)又恨。愛(ài)的是您可以利用它來(lái)牢牢固定一些難標(biāo)記的物質(zhì)，如某些分子量小，疏水性氨基酸殘基少的蛋白，這幾乎相當(dāng)與共價(jià)結(jié)合了。如通過(guò)巰基化，您還可以將一些小分子的抗原與膠體金標(biāo)記。另外，通過(guò)加入巰基化的封閉劑，您可以大大增加膠體金結(jié)合物的穩(wěn)定性。
有的采用此方法封閉，膠體金結(jié)合物在兩年內(nèi)活性幾乎沒(méi)有下降。恨的是萬(wàn)一您標(biāo)記物中的硫原子過(guò)多，它又很容易在膠體金之間起到橋聯(lián)的作用，而使膠體金相互凝集。在一些情況下，即使您將標(biāo)記的p H調(diào)節(jié)到12以上，膠體金仍然會(huì)凝集的。
最后一點(diǎn)，標(biāo)記物是結(jié)合在膠體金二十面體的棱角上的，而不是棱角上所圍成的面上，可能與我們想象的有一點(diǎn)點(diǎn)差異。
注：本文轉(zhuǎn)自《體外診斷IVD知識(shí)庫(kù)》