1、為啥要進行封閉？
在體外診斷領域常用的方法學中，無論是免疫層析或是板式ELISA，膠乳免疫比濁或是磁微粒化學發光，或是更新的微流控技術，只要涉及了固相介質及免疫反應，都需要考慮由于反應體系中的蛋白質或生物分子與固相介質間的非特異性吸附，而給反應的特異性和靈敏度帶來的負面影響。為了阻止這種非特異性吸附，使用不會參與反應的物質對固相介質表面進行封閉是一種很有效的方法。簡單地說，在免疫學實驗中，通常使用封閉劑來減少非特異性結合。
固相載體表面(如ELISA板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞，通過電轉或包被，膠上的蛋白被轉移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合于表面。
蛋白塞進了表面的很多洞洞里面，但蛋白并不是連續的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些洞洞并沒有填進東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣，就會有很多非特異性的信號。
封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結合，同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上，因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結合位點以避免一抗的非特異結合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結合在空白位置上。這樣，抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。
封閉劑應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白、不結合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。
2、理想的封閉劑應該是這樣的：增強信噪比，降低非特異性結合，支持穩定
--可以有效的阻斷蛋白質等生物分子結合到固相介質表面
--不影響已包被到固相介質表面的試劑的有效性
--不與反應體系中其他試劑有效成分發生交叉反應
--不具有影響反應底物增強或減弱信號的能力
--可以起到固相表面偶聯分子穩定劑（防止變性）的作用
--批間差小
3、常見的封閉劑
3.1 脫脂奶粉
脫脂奶粉含有牛奶中的多種蛋白質，如乳清蛋白和酪蛋白，是最常見的封閉劑之一。像WB和ELISA板等固相表面空洞大小不均勻，不同分子量蛋白種類多的奶粉蛋白(BSA只是一種蛋白)，封閉起來更全面。
價格便宜，易制備，因含多種不同分子量的蛋白，故封閉起來更全面。
缺點：成分復雜，適用范圍窄。不適用于生物素和堿性磷酸酶標記的抗體系統，由于牛奶中含有磷酸化的酪蛋白，可被抗磷酸化酪氨酸的抗體識別，導致抗體的非特異性結合進而形成高背景結果，因此在檢測磷酸化蛋白時，不建議使用脫脂奶粉。此外使用含有生物素（Biotin）的檢測體系時，也不能使用牛奶，因為牛奶也中存在Biotin。且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的生產中較少應用。
3.2 BSA
BSA 成分單一適用于大多數情況。常用濃度為 1% ~ 3%。BSA的售價較便宜，且可在4℃下以固體形態干燥保存或用滅菌水配成溶液保存。BSA用作封閉劑已獲普遍認可，其可很好地與中、高吸附強度的固相載體表面結合，且與蛋白A相容。
BSA的售價較便宜，易配置，成分相對單一。
存在批間差異性，主要由所含脂肪酸引起，故 BSA 用作封閉劑時應盡可能地降低其中的脂肪酸含量；含有磷酸酪氨酸，會與抗磷酸酪氨酸抗體發生交叉反應；若免疫原是偶聯BSA的， BSA有很強的免疫原性，會導致產生很多的針對BSA的抗體，為避免交叉反應，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉劑封閉；不能封閉離子型、共價型和具疏水性的固相載體表面。
3.3 酪蛋白
和BSA作用類似，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負電性，與同樣帶負電荷膠體金之間存在排斥力，而膜一般都是帶正電荷，會與酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封閉效果好些。
成分單一，比較常見，對于BSA不適用的情況建議選用。
普通酪蛋白不易溶解，必須知道casein就是一種磷酸化蛋白，因此不能用于磷酸化的檢測。
3.4 魚膠
魚膠蛋白為小分子多肽，相比于大分子蛋白，與轉印膜結合效果效果好、封閉效率更高，可有效降低因封閉不足導致的高背景；魚膠相比BSA和牛奶，不會與哺乳動物蛋白質發生交叉反應，能有效降低背噪，提高信噪比，增強抗體信號，為抗原-抗體結合提供了絕佳的反應環境，能節約抗體使用；預混TBST，加入蒸餾水2分鐘速溶，可在15分鐘左右快速完成封閉操作并能保證與常規封閉劑相同的效果，大幅縮短封閉時間。
魚膠蛋白更常用于免疫組織化學，在WB實驗中，2%魚膠蛋白可用作封閉劑。
由于魚膠含有內源性生物素，它不能與Biotin檢測系統一起使用。
3.5、 血清
封閉劑血清的原理主要有兩點，第一是待檢樣本會有些與蛋白非特異性結合的物質，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區別。第二是待檢樣本中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc受體。
免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清不能含有目標蛋白，且與一抗來源不同，一般選擇和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合， 會造成背景。另外二抗因盡量少選取兔子或老鼠來源的，因為這兩個在親緣關系上和人類非常接近，所以產生交叉反應的機會就比較大，從而導致背景比較高。適合選用來源于驢，山羊，綿羊等的二抗/血清，背景相對就很低。
特別注意，某些封閉血清中可能含有疊氮鈉，因此不適用于HRP酶標的檢測體系。
3.6 非蛋白物質
甲醛：可與聚偏氟乙烯制固相載體表面的微結構反應或結合，使之失去與蛋白結合的疏水力或空間結構域。
Polyvinylpyrrolidone (PVP)：是一種非蛋白類的水溶性聚合物，也是一種常用的封閉劑。可以結合NC膜或PVDF膜，與其它封閉劑聯合使用，起到封閉作用。尤其對于小分子的檢測，大分子量的封閉劑的空間位阻，會影響小分子的結合。像PVP這樣的封閉劑有很多，比如PVA，S7，S9等表面活性劑。
去污劑(吐溫-20)：有抗原修復的作用，與膜疏水性吸附，有很強的對非特異性吸附的洗脫作用，同樣可以降低蛋白間的疏水作用，可提高特異性抗體的識別能力。吐溫 -20 是一種非離子型去污劑，有使抗原復性的作用，可為固相載體表面疏水性吸附，具有很強的非特異性吸附洗脫作用，同時可降低蛋白間的疏水性相互作用，提高特異性抗體識別能力。不過，吐溫 -20 封閉液的封閉效果不穩定，易被水或緩沖液洗脫。因此，在吐溫 -20 單獨用作一種封閉劑時，后續操作中的稀釋液和緩沖液里均應有一定量的吐溫 -20 成分。吐溫 -20 與蛋白類封閉劑聯用可洗脫其他已非特異性結合至固相載體表面的雜蛋白，此在ELISA 中非常有用。但在脂多糖的測定中不能使用吐溫 -20 封閉液，因兩者間會發生交叉反應。
尤其是在側向層析產品中，應用相當廣泛。非蛋白類的封閉劑還包括糖類，蔗糖以及PEG也是一種很好的封閉劑，除了具有良好的封閉效果，還會起到穩定蛋白的作用。
3.7 還有一類特殊的封閉劑屬于特殊的有針對性的的封閉，最著名的就是HAMA免疫分析中出現問題的一個常見原因是干擾性抗體，如眾所周知的人抗鼠抗體（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗動物抗體、嗜異性抗體（Id）或類風濕因子（rheumatoid factors，RF）。一般來說，這些抗體干擾主要發生在夾心法的免疫分析中，即基于捕獲抗體和檢測抗體。干擾性抗體可以交聯捕獲抗體和檢測抗體，導致假陽性結果。或者，它們可以阻止抗原與檢測抗體的結合，甚至引起檢測抗體的聚集，導致假陰性結果。由于這種封閉劑的針對性很強，一般情況下都稱之為“阻斷劑”，中文用詞講究。