一、背景及技術原理
流式熒光技術，是基于編碼微球和流式技術的一種臨床應用型的高通量發(fā)光檢測技術，又被稱為液態(tài)芯片、懸浮陣列及Luminex? xMAP技術等。該項技術是繼生物芯片技術、化學發(fā)光技術之后的新一代高通量分子診斷技術平臺，是臨床診斷領域及生命科學研究中的一大熱點。其綜合了有色微球、應用流體學、激光技術及高速數(shù)字信號處理技術的技術優(yōu)勢，目前已被廣泛應用于免疫分析、核酸檢測、酶學分析、受體和配體識別分析等研究領域[1]。
流式熒光技術是首個通過FDA認證的臨床應用型高通量診斷技術,并被全球科技產(chǎn)業(yè)和行業(yè)的權威機構Frost&Sullivan授予“2005年度診斷技術革新大獎”殊榮。相關的研究論文在《自然》、《臨床化學》等權威學術雜志上頻頻發(fā)表。以目前主要的儀器機型 Luminex 200TM為例，平臺中包含一種直徑5.6 μm的聚苯乙烯微球，其被兩種光譜特性不同的熒光染料染色。通過精確控制兩種熒光染料的濃度配比（10×10），可以獲得一個100種熒光編碼的微球陣列，每種微球表面可結合一種反應物。微球表面擁有108個活化羧基基團，可以與蛋白抗體的氨基或核酸探針的氨基共價交聯(lián)。由于微球可通過其編碼熒光被識別，因而可以實現(xiàn)在一個混合反應體系中同時進行100項反應的檢測。另一種熒光物質與報告分子交聯(lián)，用于測定微球表面生物反應的量。在高速通過的流體束中，微球逐顆被兩束激光進行分析。一束635nm的紅色激光激發(fā)微球自身的熒光物質，而另一束532 nm的綠色激光激發(fā)結合在微球表面的報告熒光物質（藻紅蛋白、Alexa 532或Cy3）。高速的激光信號處理讀取微球編碼對其分類，同時對其表面的反應進行定量。每種檢測物的檢測讀取100顆微球的信號值，取中位值。在xMAP技術的基礎上，Luminex公司于2007年推出的新一代液相芯片檢測平臺Flexmap 3D進一步提高了檢測精度和線性范圍。Flexmap 3D技術通過加入3種不同的熒光素,根據(jù)熒光素的比例不同可同時對一個樣本中的500種不同目的分子進行檢測,并且可以一次檢測384個不同樣本。
簡要來說，在進行多重指標的聯(lián)合檢測時，首先將針對不同檢測物的核酸探針/抗體或抗原以共價交聯(lián)方式結合到特定熒光編碼的微球上，通過免疫反應或核酸雜交，使待定熒光編碼微球與被測物（可以是血清中的抗原/抗體或酶等，也可以是PCR產(chǎn)物）及熒光示蹤物特異性結合，檢測時微球排成單列通過檢測管道，進行熒光信號的讀取報告。
二、技術特色及優(yōu)勢
相比于傳統(tǒng)的固態(tài)芯片雜交、ELISA及化學發(fā)光法等，流式熒光法具有諸多突出優(yōu)勢：
1、流式熒光技術具有通量高、速度快、操作簡便等特點，一次檢測可高達100個指標，同時可實現(xiàn)樣本的批量處理。高速的激光信號處理，30s即可出一個樣本報告，可高達10000測試/小時。平臺的整個反應過程只涉及加樣和孵育，反應所需的時間短，雜交后常不用清洗，即可直接讀數(shù)，尤其適用于多指標的聯(lián)合檢測。
2、流式熒光技術的檢測結果更可靠。其檢測下限低至0.01pg/ml，而傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)僅為μg級，靈敏度提高了10—100倍。相比于ELISA法，流式熒光法的線性范圍也更寬，可達3-5個數(shù)量級。此外，流式熒光技術具有很好的重復性，采用類均相的反應模式，其結果穩(wěn)定，重復性非常好。檢測時，抽取其中的100顆微球讀數(shù)，數(shù)據(jù)取其中位值，減小誤差。
3、流式熒光技術所用的標本量更少，一次檢測僅需10-20μl，遠小于傳統(tǒng)化學或電化學發(fā)光法，更適合珍貴樣本。此外，試劑耗材等的用量也更少。
4、流式熒光技術具有更廣的適用性。在Luminex 200TM上即可以檢測蛋白又可以檢測核酸，既可用于臨床又可以服務于科研，不斷推出的新產(chǎn)品使其具有很好的平臺延展性。
三、應用領域
流式熒光技術一經(jīng)推出即在醫(yī)學檢驗及生命科學領域受到了了廣泛關注和積極的推動。其在HLA配型、SNP分型、微生物的檢測、基因突變檢測、腫瘤標志物檢測、HPV分型等眾多免疫、分子檢測領域具有廣泛應用。
1、腫瘤標志物
Sun等[2]基于Luminex 100平臺，建立了5個腫瘤標志物的聯(lián)檢方法，與傳統(tǒng)的ELISA法相比，不僅省時省力，且有更寬的線性范圍。謝沖等[3]建立了Luminex液相芯片同時檢測tPSA、fPSA的方法，與ELISA測定結果高度相關，且顯示了靈敏度高、重復性好、系統(tǒng)誤差小等優(yōu)點。在流式熒光平臺上，Doseeva等[4]對NCLC確診患者及有同等吸煙史的陰性對照的腫瘤抗原（CEACA125CYFRA21-1）和自身抗體(NY-ESO-1)進行了測定，并構建了肺癌預測模型。Ca?adas等[5]采集了43名非小球細胞肺癌（SCLC）患者的診斷及預后的血樣，并同時利用Luminex技術對血清中血管生成素相關細胞因子（血管生成素-2、VEGF-A和D）進行測定，結果發(fā)現(xiàn)顯著高出常人的量，為血管生成素-2導致SCLC不理想的臨床表現(xiàn)提供了新的證據(jù)。Chen等[6]基于該技術發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞結合血清中CEA水平監(jiān)控可有效提高NCLC的臨床預測率。Song等[7]利用流式熒光技術研究比較了卵巢癌篩查時用血清和尿液樣本中生物標志物的表現(xiàn)差異。Nassi等[8]利用流式熒光技術，發(fā)現(xiàn)腫瘤標志物HE4、CA125的聯(lián)合檢測可有效輔助評估上皮性卵巢癌復發(fā)的風險。
2、細胞因子與自身免疫疾病
Luminex xMAP技術常被用于細胞因子的測定。如Dernfalk等[9]成功將Luminex xMAP技術用于IL-1、IL-6及α-TNF。Mi?elsone等[10]在研究吸煙對心血管炎癥狀態(tài)的影響時，單核細胞趨化蛋白1、α-腫瘤壞死因子及白介素6的測定也使用了xMAP技術。錢源等[11]在此技術平臺上進行了與胰島素抵抗相關的脂肪細胞因子水平在妊娠期糖耐量受損孕婦中的相關性研究,發(fā)現(xiàn)血清瘦素水平與妊娠期糖耐量受損(GIGT)密切相關,如果改善血清瘦素水平,提高胰島素敏感性,將對 GIGT的防治有重要的臨床意義。而IL-6、TNF-α、MCP-1等細胞因子水平與GIGT則無關。Preuner等[12]使用Luminex xMAP技術，對大范圍的臨床相關致病真菌進行了特異性種屬鑒定。Szliszka等[13]在研究阿替匹林C對活化的RAW264.7巨噬細胞炎癥反應的抑制作用時，即使用該技術測定培養(yǎng)上清中巨噬細胞釋放的各種細胞因子的量。Rusnak等[14]在確定玻璃體視網(wǎng)膜的病變程度時，也用到了液相芯片法測定前房細胞因子的濃度。Lang等[15]基于Luminex xMAP技術測定了P13K抑制劑對一組人神經(jīng)母細胞瘤的抑制效用，構建出P13K磷酸蛋白輪廓，對于特異性P13K靶向治療具有指導意義。
馬小美等[16]將流式熒光技術引入系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血IFN-γ、IL-6及IL-7的檢測研究中，發(fā)現(xiàn)患者外周血中上述細胞因子表達失衡，即CD4+T輔助細胞亞群失衡，參與了疾病的發(fā)生過程和發(fā)展。Cho等[17]利用Luminex 200平臺，對包括IL-6在內的細胞因子進行測定，發(fā)現(xiàn)低水平的血清IL-6可作為乙肝病毒相關性肝癌在治愈性治療后復發(fā)的預測標志物。
Wang等[18]通過使用Luminex 200對轉移性胃腺癌患者及未患病對照血清中的炎癥因子進行測定，發(fā)現(xiàn)有幾種炎癥因子與轉移性胃腺癌病變程度密切相關。
3、核酸表達及突變的檢測
Yang等[19]建立了一種微球陣列用于基因表達檢測的方法（BADGE），生物素標記的cRNA與結合在微球上的互補捕獲探針雜交，用于對擬南芥特定基因的表達進行定量。測試結果與GeneChip Probe等同，且靈敏度低至10-30 copy/細胞，可用于中等基因表達量的檢測。Wang等[20]利用Luminex xMAP液態(tài)芯片技術，測定了非小球細胞肺癌組織中miRNA的表達量，由于該技術呈現(xiàn)諸多優(yōu)點，如所需樣本量少、無需擴增、檢測速度快等，作者認為該技術是用于miRNA高通量檢測十分優(yōu)良可行的方法。此前，Lu等[21]也曾將該平臺應用到了多種腫瘤相關的miRNA表達譜的構建上。結果顯示流式熒光法的特異性要明顯優(yōu)于固態(tài)芯片法，且與反向斑點雜交法的檢測結果完全一致。流式熒光法除了準確性高、高效率低、成本外，具有更好的靈活性，可用于發(fā)現(xiàn)新的miRNA。Xun等[22]提出將微陣列、Luminex及CyTOF等高通量方法結合起來，用于監(jiān)測免疫全程的轉錄、翻譯及翻譯后修飾各水平。
Colinas等[23]使用直接雜交法對新生兒血斑DNA的PCR產(chǎn)物進行β-globin變體的多通道分型，結果顯示該法能有效區(qū)分β-globin基因的S及E等位基因及其野生型的血紅蛋白（Hb）A等。Dubar和Jacobson[24]將14個人DNA樣本經(jīng)PCR擴增后連接生物素，使用多通道的直接雜交法對囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)蛋白（CFTR） 的5個突變體進行了準確地測定。Hadd等[25]建立了一種三通道直接雜交法用于分對CFTR基因的內含子8 進行5T/7T/9T多態(tài)性分型。Wallace等[26]結合多通道PCR及xMAP多通道直接雜交法，開發(fā)出一種微球陣列編碼測定急性淋巴細胞白血病的方法（BARCODE-ALL），用于測定小兒淋巴細胞白血病中出現(xiàn)的染色體易位導致的融合轉錄本。Yeom等[27]將該方法用于男性不育中Y染色體微缺失的診斷，結果顯示高靈敏度和高通量的特性。劉仁旺等[28]聯(lián)合使用RT-PCR和流式熒光法，比較研究了 EGFR 19和21外顯子突變肺癌患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)EGFR 19突變肺癌患者相對EGFR 21突變肺癌患者年齡較小，且右側原發(fā)較為多見。兩者在性別、吸煙狀況、組織類型、分化及分化程度上無明顯差別。張卉等[29]在對肺腺癌EGFR及KRAS基因突變狀態(tài)的研究中，使用流式熒光法測定突變基因，發(fā)現(xiàn)肺腺癌EGFR基因突變在女性及不吸煙者中較高，而KRAS只在EGFR基因野生型患者中較高，提示使用TKI靶向藥物前，應同時對EGFR及KRAS突變狀態(tài)進行檢測。
4、HPV分型
流式熒光平臺在HPV DNA分型中具有廣泛的應用。齊淑貞等[30]研究比較了測序法和液相芯片法對生殖道HPV的分型效果，在多型別的感染中，液相芯片法展現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。劉思瑤等[31]也用流式熒光法對疑似HPV感染的病例進行分型，發(fā)現(xiàn)比反向點雜交法的多重感染陽性檢出率要高出4%。蔣漢梁[32]以流式熒光技術為平臺，設計了HPV特異性探針，獲得了很好的檢測效果，并統(tǒng)計出了浙江地區(qū)宮頸癌病變程度與HPV感染亞型之間的關系。此外，袁定芬等[33]利用該技術對上海地區(qū)尖銳濕疣患者的HPV進行了分型統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)常見的三種分別為HPV16、52和18，并且對宮頸陰道脫落細胞和尖銳濕疣組織中的HPV進行了基因型的比較[34]。Chung等[35]基于流式熒光法建立了一種可對20種高危型和5種低危型HPV進行分型的方法，發(fā)現(xiàn)對高度病變和高危型HPV感染檢測的準確度很高。
此外，Schmitt[36]結合多重PCR技術，成功地將Luminex xMAP技術用于牛乳頭瘤病毒的分型。
5、SNP分型
單核苷酸多態(tài)性（SNP）是人基因組中豐富的序列變異，是用于疾病特異性位點鑒定的重要標志物，同時也多用于疾病和藥物敏感性的預測。基于 xMAP技術的懸浮陣列分析被廣泛地應用于SNP的研究，研究手段包括基于微球的直接雜交法以及利用等位基因特異性引物延伸法（ASPE）、單堿基延伸（SBE）、寡核苷酸連接分析（OLA）等基于溶液的微球捕獲基因分型。
Armstrong等[37]使用直接雜交法開發(fā)并驗證了一種SNP 32分型的分析方法，可同時對8個不同多態(tài)性基因進行測定。Iannon等[38]通過在微球上進行OLA分析對來自7個不同DNA樣本ApoE位點附近的9個SNP位點進行分型，在OLA反應過程中，一段特異性的捕獲序列（Zipcode）被連到產(chǎn)物上去，因而能與微球上互補的捕獲探針（cZipcode）雜交。與單通道檢測相比，18通道的熒光信號沒有絲毫損耗，顯示出分析快速、節(jié)省試劑、通量高及準確度高等特點。Chen等[39]基于Zipcode/cZipcode系統(tǒng)利用單堿基延伸法（SBCE）對ApoE基因上的58個SNP位點進行分型。首次實驗中58個SNP被成功分型。在21和34通道中，共計181個SNP被檢出，且檢測結果與DNA直接測序及Taqman高度一致，其余3個歸因于實驗失誤。Cai等[40]使用類似的方法用于鑒別HLA DPB1位點上GLU96的變體以及HLA DPA1上的8個SNP。通過該方法，他們成功對30個樣本各自兩個染色體上的8個位點進行了分型，共計480個位點。Pickering等[41]通過在Luminex FlexMAP上進行ASPE反應，建立了一種對細胞色素 P450（CYP）2C9和2C19基因分型的方法，用該法測定的等位比例的批內及批間CV值分別為≦4.1%、≦9.1%。Maria等[42]基于此技術研究證明眼部弓形蟲病與MHC I類鏈相關的A基因多態(tài)性及HLA-B、HLA-C等位基因的連鎖不平衡之間并不顯著相關。Bortolin等[43]基于Luminex xMAP技術開發(fā)出一個用于檢測血栓形成相關的基因多態(tài)性的平臺，與直接測序結果比對顯示對于736個SNP位點的測試完全吻合。
6、HLA基因分型
Fulton等[44]報道了用xMAP懸浮陣列法鑒別HLA的等位基因，HLA DQA1基因第二個外顯子中的等位序列含17個寡核苷酸，在進行多通道的競爭性雜交時，將其作為雙鏈寡核苷酸的探針。在檢測前，與探針互補的被標志的寡核苷酸先與未被標記的雙鏈模板雜交，隨后與交聯(lián)在微球上的等位基因特異性的模板雜交。Ito等[45]利用流式熒光技術揭示了HLA-DRB1*0405、DQB1*0401以及DQA1*0303等位基因與拉莫三嗪ADRs之間的關系。Vilches等[46]在Luminex平臺上對有過孕育史的女性外周血中抗HLA抗體進行了測定，結果顯示懷孕所致的HLA敏化作用的高發(fā)性，作者提出對有過孕史的女性進行HLA分型對移植手術的風險評估具有很大的意義。Nishimura等[47]通過用Luminex 200對HLA-A、B及DRB1等位基因進行測定，發(fā)現(xiàn)HLA-B*15:01聯(lián)合DRB1B*15:01等位基因與進行性胰腺癌患者中吉西他濱及埃羅替尼所致的肺部間質疾病的發(fā)生有關。
在越南地區(qū)，由卡馬西平引起的嚴重皮膚不良藥物反應（ADRs）高發(fā)。Nguyen等[48]通過結合PCR技術和序列特異性寡核苷酸探針，利用流式熒光技術對越南河內一所大型醫(yī)院的38例有卡馬西平ADRs的患者的HLA-B*1502等位基因頻率進行測定統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)該等位基因與卡馬西平ADRs的密切相關性。
7、環(huán)境微生物的檢測
傳染性微生物的分子學鑒定在衛(wèi)生、水質及食品工業(yè)等領域有廣泛應用，而Luminex用于細菌、病毒、致病真菌的鑒別也有一席之地。Smith等[49]基于Luminex FlowMetrix系統(tǒng)開發(fā)了一種用于病毒核酸的多通道分析定量方法。在對HIV、丙型肝炎病毒（HSV）及單純孢疹病毒（HSV）等進行擴增時，病毒的內部擴增質控也一同擴增，并通過直接雜交法與連接在微球上的特異性探針雜交檢測。Spiro等[50]報道了一種基于微球的分析方法，用于對環(huán)境DNA的PCR產(chǎn)物進行鑒定和定量。Ye等[51]通過多通道SNP分型對17種革蘭氏陽性和陰性菌的不同16S rDNA進行鑒別，所用的ASPE和SBE法結果均與直接測序法一致。直接雜交法在食源性疾病中常見病原微生物的檢測和定量具有廣泛的應用。Daiz和Fell[52]建立了一種鑒定毛霉菌屬的直接雜交法。Ishii等[53]首次將PCR-Luminex系統(tǒng)引入致病真菌的分子診斷，研究其抗藥性和種屬特異性，對農(nóng)作物的防護及農(nóng)業(yè)科學的發(fā)展具有重要作用。范麗等[54]基于流式熒光技術建立了可同時檢測六種蟲媒病毒的方法，多批次實驗均未出現(xiàn)交叉反應，批間CV值均小于7%，穩(wěn)定性和特異性均較好，與ELISA法相比，靈敏度更高、重復性更好、時間更短且成本更低。呼吸道感染會加大醫(yī)院和急診中心的就診量，造成很大的醫(yī)療壓力。對有上呼吸道感染癥狀的患者進行快速的呼吸道病原體檢測對做出有抗菌策略、避免不必要的診斷和實施減少疾病傳播的手段?？焖俚牟≡w診斷也有助于節(jié)省醫(yī)院開銷、縮短療程等。
流式熒光技術在呼吸道病原體的檢測中也有其廣泛應用。Hwang等[55]Luminex xTAG技術用于流感病毒及呼吸道合胞病毒的檢測，表現(xiàn)出的靈敏度和特異性均很高。Tang等[56]采用Luminex NxTAG對404例呼吸道標本的病原體群進行檢測評估。與推薦方法相比，此法的臨床靈敏度和特異性分別為80.0-100.0%、98.9-100.0%。對流感A病毒的正確分型率達95.5%。封閉試管簡化了工作流程并減少了污染。緊隨其后，Chen等[57]對此法用于呼吸道病原體群的多聯(lián)檢進行了評估?？傮w上，此法對絕大多數(shù)的病原體具有良好的檢測效果，由于此法通量高、周轉時間較短，因而可適用于醫(yī)院實驗室常規(guī)的呼吸道樣本的多聯(lián)檢篩查。Wang等[58]基于流式熒光技術，開發(fā)出了檢測B19V、巨細胞病毒及弓形蟲抗體的單檢及聯(lián)檢技術，此法不僅具有高靈敏度、高特異性，且具有很寬的線性范圍。此外，流式熒光技術在細胞信號通路調控及激素的表達以及優(yōu)生優(yōu)育TORCH項目等方面也具有廣泛的應用。許維東等人[59]將此技術用于測定氨甲喋呤（MTX）對映體耐藥A549細胞株中的磷酸化酪氨酸激酶受體，并發(fā)現(xiàn)在MTX對映體誘導的耐藥細胞株中，p-EGFR表達水平存在手性差異。Khan等[60]人將流式熒光技術用在了淋巴細胞的胞內信號通道多通道的分析研究，與免疫沉淀反應、免疫印跡以及ELISA等方法相比，展現(xiàn)了諸多優(yōu)勢。徐潞君[61]將該技術用在了慢性腎臟病腎組織的AKT/mTOR信號通路研究中，找出了可能的生物標記物，并探討了AKT通路因子與相關臨床指標之間的關系。劉民等[62]用液相芯片技術建立了促甲狀腺激素的檢驗方法，其主要技術指標與拜爾的化學發(fā)光法相近，具有臨床應用價值。
四、小結與展望
上世紀90年代中期，隨著以功能基因組學和蛋白質組學為核心的后基因組時代的到來，流式熒光技術應運而生。從發(fā)明至今不過二十年左右時間, 卻已經(jīng)應用于生命科學研究和臨床中的諸多領域。實際上，流式熒光技術由于其高通量、高效率、線性范圍寬、高靈敏度和高特異性等顯著優(yōu)勢，已逐漸取代 EL ISA 等傳統(tǒng)的檢測手段, 在臨床上被廣泛地用于腫瘤標志物的檢測、遺傳性疾病的基因診斷、HLA分型、病原體鑒別以及自身免疫性疾病的早期診斷等方面。此外, 隨著微流體技術、激光技術和數(shù)字信號處理技術研究的不斷深入, 流式熒光技術還將在醫(yī)學基礎研究、新藥物的開發(fā)、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督及環(huán)境監(jiān)測等領域具有更廣泛的應用前景[63]
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來源：上海透景生命科技股份有限公司
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