1， 定量標記免疫分析方法分析性能評估的主要指標
1.1 靈敏度
1.1.1 分析靈敏度：試劑盒的靈敏度即最低檢出量是指在統計學意義上能與零劑量區別的量。一般用95％可信限計算：重復測定零劑量點（n≥10），計算反應量的均值（x）和標準差（SD），以x+2SD（夾心法試劑盒）或均值x-2SD（競爭抑制法試劑盒）的反應量計算出相應的濃度，即為該試劑盒的分析靈敏度，這是我們注冊資料所需提供的內容。
1.1.2 功能靈敏度：將低值樣本倍比稀釋后重復測定（n≥10），計算反應量的變異系數（CV%），CV%大于20％時所對應的劑量點，即為該試劑盒的功能靈敏度。
1.2 特異性
誠如我們所認識到的，標記免疫分析是特定抗體對特定抗原的特異識別。不同來源的抗體與結構類似物結合從而產生交叉反應是客觀存在的，因此特異性檢驗是正確認識該試劑盒對結構類似物抗干擾能力的指標。特異性檢驗通常有兩種標定方法：
1.2.1 交叉反應率：一定濃度的結構類似物在本試劑盒上的測定結果（物質的量）與該類似物的量的比值的百分率。如：1000 pmol/L 的結構類似物，在某試劑盒上測定結果是5pmol/L，其交叉反應率＝5pmol/L/ 1 000 pmol/L * 100%=0.5%。
1.2.2 實際測量值：對于不能用物質的量表示的被測物，如糖蛋白激素FSH、LH、TSH和HCG，這4種激素具有相同的α亞單位，僅僅是α亞單位上部分氨基酸不同，實際操作中很容易產生交叉反應，而這4種激素又分別有各自的同形異構物，其量的表達方法還不能用物質的量（mol/L，ng/mL）表示，而只能借助于生物測定的活性單位（IU/L，mIU/L）表示，而每一種激素的活性單位（IU）又有完全不同的生物學意義，相互之間沒有任何關聯，即并且每一種激素定義的單位意義完全不同，不同來源相同質量的某一種激素的活性單位也不同，它們之間的交叉反應絕對不能用交叉反應率表示，因此往往選擇實測值表示。
1.2.3 選擇交叉反應對照物：當交叉反應的測量結果高于我們期待的結果時，可以從兩個方面分析：首先，該試劑盒抗體確實與這一交叉反應因子存在交叉反應，如FSH在結構上與另外3 種激素僅僅是α亞單位上個別氨基酸的不同，其特征抗體與其它位點有一定程度的結合的可能性是存在的，這種非特異結合被限制在一定范圍內是可以接受的。在另一方面，如果選擇的交叉反應對照物中含有少量的被測物，如：欲考察FSH試劑盒對LH的交叉反應，選擇的LH抗原中含有少量的FSH，高濃度的這種抗原在FSH試劑盒中的測量結果很可能高于所期待的結果，應充分認識到這種結果并不是由于FSH抗體的交叉反應引起的。因此，當交叉反應的測量結果高于我們期待的結果時，可以選擇另一來源的交叉反應對照物重新測試，以排除由于抗原不純而引起的對該試劑盒抗體交叉反應的誤解。
1.2.4 交叉反應物對測定結果的影響：多大的交叉反應是可能接受的，主要取決于被測物和交叉反應物在人體內的相對含量。如3，5，3’-三碘甲腺原氨酸(Triindonhyroxine，T3)和甲狀腺素(Thyroxine，T4)，因為血清中T4的含量是T3 的近千倍，所以對于測量T4的試劑盒而言，與T3存在10%以下的交叉反應率都不會影響T4的測定，而如果對于測量T3 的試劑盒而言，即使與T4存在1%的交叉反應率，都會嚴重影響T3的測定。
1.2.5 其它影響因素：評價試劑盒時還應注意其它因素，如：溶血、高血脂、抗凝劑、其它藥物、異嗜性抗體及自身免疫性疾病患者等對樣本測定結果的影響，這種影響對不同方法、不同檢測項目的影響程度是不一樣的，應逐一充分認識。此部分內容可放入抗干擾能力。
1.3 劑量－反應曲線建立
定量標記免疫分析的最主要特征就是建立劑量－反應曲線，通過已知濃度的校準物質（自變量，X）和相應的反應量（因變量，Y）建立劑量－反應關系，并同時測量待測品，通過待測樣品的反應量（Y'），計算出未知樣品的濃度（X'），因此，這種劑量－反應關系需要有良好的相關性，即統計學上的“相關系數（r）”（coefficientcorrelation），當相關系數越趨近于1時，表明劑量－反應關系越密切。建立劑量－反應曲線時應注意：
1.3.1 選擇適當的數學模型擬合
如前所述，在評價試劑盒時，我們通常用雙對數（適用于非競爭性雙位點夾心法標記免疫分析）數學模型和log-logit（適用于競爭法標記免疫分析）數學模型。一般認為，經適當的函數轉換后的標記免疫分析的劑量－反應相關系數或其絕對值（r或|r|）應不低于0.9900。
1.3.1.1 雙對數數學模型：顧名思義，雙對數數學模型因函數自變量（劑量）和因變量（反應量）都經對數轉換而得名。自然對數和常用對數對劑量－反應曲線的影響僅僅在于截距（A）的不同，通常我們取自然對數：lnY=A+B*lnX。大量的經驗表明：多數夾心法標記免疫分析（特別是微量或超微量分析，小于10－9克）經雙對數函數轉換后，相關系數都能大于0.9900；對于微克級的被測物，選擇半對數函數有時能得到更好的相關系數。
1.3.1.2 log-logit 數學模型：經驗表明，對于抑制法標記免疫分析，log-logit數學模型因其計算方法相對簡單，且大多數情況下可以得到較好的相關性，因此是評價這類試劑盒的首選數學模型。方程式：
logit Y=A+ B*log X，式中：logitY=B/B0 /( 1－B/B0)
對于這類試劑盒，還應要求有效劑量值（ED25、ED50、ED75或ED20、ED50、ED80）應在劑量－反應曲線最高濃度點和最低濃度點之間，即25%（或20%）結合率（B/B0%）所對應的劑量濃度點應小于曲線最高劑量點，75%或（80%）結合率（B/B0%）所對應的劑量濃度點應大于曲線最低劑量點，使曲線在規定的劑量范圍內有足夠的落差。
1.3.2 標記免疫分析在選擇了特異抗體對特異抗原的特定識別以后，劑量－反應曲線在適當濃度的抗原、抗體配伍下，在一定范圍內，應呈現良好的相關性，相關系數或其絕對值（r或|r|）應不低于0.9900。否則應從如下幾個方面考慮：
①抗體的濃度是否與抗原濃度相適應；②選擇的劑量范圍是否合適；③選擇的函數方程是否合適。
1.4 精密度評價
精密度是考察試劑盒對同一樣本重復測定時能否得到相同實驗結果的能力的指標，通常用重復多次樣本測量結果的變異系數（CV%）表示，精密度評價是質量控制的重要內容。
1.4.1 分析內(intra assay)精密度：同一次實驗內（同一塊微孔板上或實驗條件完全相同的情況下）同一樣本（如：質控血清）重復測定（n≥10），測定結果的變異系數(CV%）應不高于10.0%。分析內精密度的變化或異常升高，應從方法學改進、實驗室條件改變、操作失當等方面排查原因。
1.4.2 分析間(inter assay)精密度：分析間精密度涵蓋的內容非常廣泛，至少應包含入下內容：
同一試劑盒，不同批次之間；同一試劑盒，同一批次，不同實驗室之間；同一試劑盒，同一批次，同一實驗室，不同操作者之間；同一試劑盒，同一批次，同一操作者，有效期內不同時間之間等。
不同層次的分析間精密度的意義不盡相同，在評價試劑盒質量時應引起質量控制工作者的足夠認識。評價分析間精密度時，同一樣本（如：質控血清）在上述條件下重復測定（一般n≥10），測定結果的變異系數（CV%）應不高于15.0%。
1.5 準確性評價
準確性評價通常指測量結果趨近于真值的程度。但是，正如我們所認識到的，對于標記免疫分析，特別是具有多種同形異構體的大分子物質而言，目前的分析方法還很難得到真值，因此，還沒有真正意義上的“準確性評價”方法，目前通常是通過標準品核對實驗或回收率實驗進行考察。
1.5.1 標準品核對實驗：試劑盒內校準品與相應濃度的國際或國家標準品同時進行分析測定，要求兩條劑量－反應曲線不顯著偏離平行（t測驗），以國際或國家標準品為對照品，試劑盒內校準品的實測效價與標示效價之比應在0.900～1.100之間。標準品核對實驗應注意：
①配制國際或國家標準品的稀釋液應與試劑盒校準物質稀釋液相同，以保證兩條劑量－反應曲線在相同反應體系下反應；②配制國際或國家標準品的濃度范圍應與試劑盒校準物質實際濃度范圍相當，以保證反應能在試劑盒工作范圍內進行。
1.5.2 回收率實驗
1.5.2.1 添加回收率：選擇經純化、分析過的，性能穩定的已知高濃度的抗原定量加入低濃度被測樣本中，并進行分析測定，測定結果與已知理論濃度相比較，應在90.0%～110.0%范圍內。
1.5.2.2 稀釋回收率：同樣選擇經純化、分析過的，性能穩定的已知高濃度的抗原，按照一定比例稀釋成系列溶液，并與試劑盒劑量－反應曲線同時測定，高濃度抗原系列與劑量－反應曲線相比較，應不顯著偏離平行（t測驗），效價比應在0.900～1.100之間。
添加抗原溶液和稀釋液同樣應與試劑盒校準物質稀釋液相同，以保證反應在相同體系下進行。
注意：至少配制3個不同濃度添加到空白中的測試物，每一濃度配制2份樣品，每1 次試驗對6份樣品重復測定3 次，比較測定值和真實值求出回收率（%），即偏差。
1.6 檢測范圍（range）
劑量-反應曲線的工作范圍(workingrange)是指能達到一定精密度、準確性和直線性時，測定方法適用的高低限度或量的區間，應使其最精密的部分即曲線斜率最大的部分適合于臨床測定需要的范圍。它既可以包括全部正常范圍(適合于高于和低于這個數值均有診斷意義的物質，如血清胰島素、地高辛測定)，也可以在正常范圍的一端(即低于或者高于這個數值，不是兩者均有診斷意義的物質，前者如血清雄烯二酮測定，后者如血清腫瘤標志物分析)。
1.7 高劑量鉤變效應（HOOK效應）
當標本中被測物濃度超過線性范圍上界時，所得結果反而降低或呈陰性，這種現象被形象地稱為高劑量鉤變效應（HD-hookeffect）。由Miles 等于1974年用雙位點IRMA 測血清鐵蛋白時發現。產生這種現象的原因可以歸納為：在一步法試劑盒中是由于大量過剩抗原與被捕獲抗原競爭結合限量的標記二抗，二步法試劑盒與抗原的“質”（表位數量及其重復表達數量）有關。固相捕捉抗體過量或有重復表達表位的抗原，呈飽和結合，標記二抗與抗原交叉重疊結合，產生立體效應，使抗原“異構”，與一抗的親和力減弱。洗滌時，標記二抗體與抗原形成的復合物自固相脫離。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤變效應的發生。使用時，可以將這些樣本進行稀釋，使其測量結果落在劑量－反應曲線內，這一測量結果與稀釋倍數的乘積即為該樣本的原始濃度。
1.8 穩定性評價
試劑盒在有效期內，在規定的條件下保存應保持穩定，各項性能指標應符合質量標準要求。穩定性的實驗室檢驗，可以通過加速降解實驗進行，通常的做法是：有效期半年的試劑盒37℃放置3天，有效期1年的試劑盒37℃放置7天后檢驗，該項性能指標均應符合產品質量標準規定。
目前國家食品監督管理局要求注冊提供的穩定性資料包括至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的穩定性研究資料。同時，穩定性資料還應包括模擬運輸情況以及開瓶穩定性研究結果等。
1.9 健全性
健全性（validity）是免疫分析可靠性指標之一。免疫化學分析原則上要求校準試劑與被測物質的免疫化學性質相同，即使兩者之間的結構有些差異，而它們的劑量-反應曲線不互相偏離平行。一般采用含被測物質的高值血清，按一定的比例稀釋，然后測定其含量。如果稀釋倍數與含量呈線性關系，那么這個分析具有良好的健全性。也可以在線性回歸之后，對校準試劑（試劑盒標準品）劑量-反應曲線的斜率（b1）與高值血清稀釋曲線的斜率（b2）的差別作顯著性測驗，以判斷這兩條曲線是否顯著偏離平行。健全性好壞可以證明未知雜質或被測樣品中是否存在交叉反應物質。應使用分析體系中的“零”制劑或分析緩沖液作為稀釋劑（diluents）來稀釋高值血清樣品，以保證稀釋樣品在理化狀態上與其它樣品的一致性。
應該注意的是：稀釋曲線應做幾次重復實驗，以排除偶然因素的影響；稀釋曲線有時與劑量相關，尤其在偏離平行時要慎重地下結論。
2， 定性標記免疫分析方法分析性能評估的主要指標
2.1 陰性參考品符合率
2.1.1 建立陰性參考品：陰性參考品1套，一般應不少于10 種不同來源的，相對于該項測定是陰性的樣本，應包含下述情況：
①正常人樣本，應考慮到不同年齡組、不同種群的變化；②定量標記免疫分析中特異性檢驗中的結構類似物。
2.1.2 陰性參考品符合率：評價試劑盒的陰性參考品符合率的理想情況應為100%，即全部檢測呈陰性。若出現陽性或弱陽性，應視具體情況具體分析。
2.2 陽性參考品符合率
2.2.1 建立陽性參考品：陽性參考品1套，至少應包含5 種不同來源的，各自有獨特代表性的陽性樣本，如強陽性樣本、弱陽性樣本，特別應注意可能引起“HOOK”效應的高濃度樣本。
2.2.2 陽性參考品符合率：同樣，評價試劑盒的陽性參考品符合率的理想情況應為100%，即全部檢測呈陽性。若出現陰性，應視具體情況具體分析。
2.3 重現性/精密性
定性標記免疫分析試劑對于同一樣本重復測定（n≥10），應取得一致的結果。即陰性樣本均應呈陰性，陽性樣本均應呈陽性。對于反應結果被量化的定性試劑盒，陽性樣本反應量的變異系數（CV%）應不高于10.0%。
2.4 cut off 值在篩查性試劑盒與診斷性試劑盒中的意義
定性標記分析試劑盒的所有分析結果都基于cutoff判定。因此，確定cut off 值對于定性標記免疫分析試劑盒至關重要。建立cutoff 值時應選擇的個體應考慮排除對被研究指標有影響的因素，且樣本量應有統計學意義。習慣上以所選總樣本的80%、90%、95%（最常用）、99%的頻數為截斷點（cutoff point），相應的劑量即為cutoff 值。
篩查性試劑盒的試驗目的是從無癥狀的人群中找出可能患有某種疾病的患者，是要減少假陰性，就應放寬百分位，通常選擇80%或90%的頻數為截斷點。而診斷性試劑盒是通過實驗室檢驗協助醫生確定患者是否患有某種疾病，要減少假陽性，就要適當放寬假陰性，取95%或99%的頻數為截斷點。因此，同一試劑盒用于篩查性目的時和用于檢驗性目的時的cutoff 值可能不同。具體可參照我整理的另一文章“關于截斷值的確認”。
2.5 穩定性
同定量試劑要求。
3 ，質控血清的制備、標定和應用
3.1 制備
理想的質控樣本至少應包含下列特征：與被測物來源相同，有一定批量，規定條件下保存性質穩定，凍干品分裝支間差異小，無傳染性等。如，甲狀腺功能檢測的質控樣本，可以分別收集甲亢、甲低和正常人血清，混合后制備的質控血清應涵蓋被測物劑量－反應曲線的低、中、高三個區域。但實際操作時由于要求質控樣本有一定的批量，可以供一段時間內連續使用，并應對血源進行生物安全性檢測，因此，收集臨床樣本制備質控血清被認為不太現實。目前通常采用的是在正常人血清中定量添加被測物的方法制備質控血清。具體方法是：
①收集一定量的被測物人血清，或制備不含被測物血清，經生物安全性檢驗呈陰性，離心、過濾、去雜質，加防腐劑；
②加入被測物高純品，分別在曲線低、中、高三個區域配制成三種濃度質控血清；
③分裝、冷干，得到質控血清成品，-20℃保存，備用。
3.2 標定和應用
選擇一定的分析系統，對質控血清進行重復測定（n≥20），計算均值和標準差，一般以均值為質控血清的靶值，均值±2倍標準差為質控血清的測定上限和下限。
實驗室在進行分析檢測時應自覺使用質控血清開展內部質量控制工作。按照規定，每次實驗中質控血清數量應為實驗總量的平方根。如，一塊96孔板的實驗中應安排質控血清數量9~10孔。每個點均應為雙復孔，且安排在微孔板的上、下、左、中、右不同位置。
3.3 記錄質控結果和繪制質控圖
確定質控血清的靶值是繪制質控圖的基礎，分別繪制低、中、高三個質控血清的質控圖。以實驗次數為橫軸，以每次實驗質控血清測定值為縱軸，繪制質控圖。建立質控圖后，每次實驗的質控血清測定值都應記錄在質控圖上。
3.4 對質控圖記錄結果的評價與分析
理想的檢測結果均應在靶值附近，明顯偏離靶值或重復偏向靶值同側的結果均應引起足夠重視。質控血清測定值的異常是實驗過程中出現異常變異的最直接的綜合反映，應根據前面講述的質量控制基本內容逐一排查原因。值得注意的是，目前應用的內部質量控制的方法僅僅能評價實驗室測量結果的可重復性（精密度），而不是它的“準確性”。
總之，一個單位在研制生產一種新的體外診斷試劑盒產品時，都要對該產品的適用性和可靠性等性能進行測定和評價，需要對下述問題進行全方位考慮：①該試劑盒是否達到了特定的要求？②該試劑盒的靈敏性、重復性、準確性和精密性方面是否達到了要求？③該試劑盒在技術上是否要求很苛刻？④臨床使用時是否需具有應用該試劑盒的專業知識？是否需要培訓？⑤該試劑盒是否需要特殊的設備？⑥該試劑盒是否造價很高？⑦該試劑盒是否需要時間過長？本文對試劑盒分析性能的評估做了詳細介紹，提請研發人員主要應對上述指標進行測定考核，以確定該產品在本研究內能夠得到準確和重復的實驗結果，并且在測定范圍、測定限度和特異性等方面達到了測定的要求，確保實驗數據的準確與可靠。在實驗設計時，一定要注意重復性問題，尤其在標準確認過程中，多復孔設計及多次重復實驗是必須的。
摘自體外診斷IVD知識庫