1. 什么是批間變異性
批間變異性lot-to-lot variance（LTLV）也稱作batch Variability,可能由多種因素引起，包括關鍵試劑的質量、穩定性和制造工藝的變化，以及原材料的儲存和處理條件等[2-4]。LTLV 對免疫測定的準確度、精密度和整體性能有重大影響，這可能導致結果不一致和不準確[5]。
２． 為什么會出現LTLV？
在技術層面，免疫測定的質量由兩個關鍵要素決定：原材料和生產工藝。據估計，免疫測定的 70% 的性能歸因于原材料，而其余 30% 歸因于生產過程（如緩沖液配方、試劑配方等）。生產工藝保證了試劑盒質量和重復性的下限，而原材料則為 IVD 試劑盒的靈敏度和特異性提供了基礎，從而形成了試劑盒質量的上限，猶如錦上添花。為了查明 LTLV 的原因和起源，有必要詳細探討這兩個方面。此外，分析物表位的不穩定性在某種程度上也會導致 LTLV。
2.1 原材料質量波動（Quality Fluctuation of Raw Materials）：免疫測定的多種成分（抗原、抗體、酶、結合物等）質量波動都可能引發 LTLV。抗原純度、穩定性等不達標會影響檢測；酶活性不一致難以控制；抗體聚集、純度不足等會導致檢測偏差；結合物因偶聯和純化問題存在缺陷；試劑盒對照品與校準品成分相同，無法有效監測校準品；緩沖液混合不充分、容器不潔等也會有影響。2.2 生產過程偏差（Deviation in the Production Process）：人員操作差異、人員變動；關鍵材料變更或更換供應商；緩沖液制備不當；設備性能受天氣影響、濕度不當等環境因素，都會導致 LTLV。2.3 分析物表位不穩定（Unstable Analyte Epitope）：血液中的蛋白酶會切割分析物，影響檢測準確性；糖基化可能干擾抗體與抗原結合，且部分分析物糖基化模式異質，導致 LTLV。
３. 如何最大限度得減少LTLV？
3.1 抗原設計
抗原設計是開發臨床應用可靠免疫測定的關鍵環節。為減少潛在問題，應避免選擇已知含糖基化位點的表位。但如果某個糖基化表位具有重要臨床意義，也可合成或表達糖基化抗原用于抗體制備。表位中應避免包含脯氨酸 - 賴氨酸、甲硫氨酸 - 纈氨酸、甘氨酸 - 半胱氨酸、精氨酸 - 異亮氨酸、亮氨酸 - 精氨酸、精氨酸 - 精氨酸或賴氨酸 - 甲硫氨酸等氨基酸序列，因為這些序列可能被血液中的多種蛋白酶切割。不過，有一種例外情況：表位中的糖基化殘基可通過阻斷酶對糖基化切割位點的接觸，從而抑制蛋白酶的加工作用 [25]。此外，在選擇抗原表位時，若上述氨基酸序列位于表位上下游 10-30 個氨基酸范圍內，也需謹慎處理 —— 因為這些位點的潛在切割可能消除空間阻礙，導致臨床樣本中分析物水平隨時間升高，進而干擾抗體與抗原的相互作用。
3.2 抗原和抗體的關鍵質量屬性
受現有診斷技術限制，通過生產過程優化來降低免疫測定批間差異的空間有限，因此原材料的質量至關重要。抗原和抗體是決定免疫測定性能的核心成分，二者各有獨特的特異性、親和力、表面電荷和溶解度等屬性。為確保抗原和抗體批次間的一致性，需進行全面的質量控制分析，包括監測濃度、免疫反應性、電荷同工型分布、純度和均一性等。關鍵質量屬性（如等電點、電荷分布、免疫球蛋白類別和亞類、穩定性及動力學常數）必須在各批次間保持一致。若這些屬性失控，可能導致一系列問題，例如每批新體外診斷試劑盒都需重新優化抗原 / 抗體用量、出現靈敏度問題、需重新優化標記 / 包被過程的 pH 或體積，以及需要去除聚集物、片段或雜質等。
3.2.1 減少抗原和抗體的聚集
為減少蛋白質聚集，建議將抗體儲備液保持在較低濃度，因為高蛋白質濃度易導致聚集。但低濃度可能導致蛋白質在容器表面吸附損失。在某些情況下，為滿足偶聯需求（如 HRP 標記），較高的蛋白質濃度是必要的。因此，理想的做法是在儲存緩沖液中添加穩定劑以減少聚集。根據作用機制，可向緩沖液中添加兩類主要穩定劑： kosmotropes（促序劑）和 chaotropes（離液劑）。促序劑（如蔗糖、甘油、甘氨酸、精氨酸 [9,29] 和山梨糖醇 [30]）通過穩定蛋白質周圍的水化層來維持蛋白質的天然結構（圖 4a）。離液劑（如鹽酸胍和尿素 [9]）通過干擾并削弱蛋白質周圍的水化層，減少或阻礙蛋白質間的相互作用（圖 4b）[31]。聚乙二醇（PEG）或非離子去污劑等大分子添加劑可直接遮蔽蛋白質上的疏水位點，從而阻止這些位點與鄰近蛋白質的疏水位點發生相互作用 [32]。其他常用添加劑包括精氨酸和檸檬酸鹽。表 3 總結了常用于減少蛋白質聚集的添加劑及其建議濃度范圍。由于不同添加劑的作用機制不同，建議嘗試多種添加劑以確定效果最佳者。尺寸排阻色譜 - 高效液相色譜（SEC-HPLC）可用于去除大量蛋白質聚集物。
3.2.2 定期監測抗原和抗體的等電點
蛋白質電荷分布的異質性可能導致蛋白質聚集，進而降低免疫測定的靈敏度。這種現象在等電點（pI）時尤為明顯 —— 此時蛋白質不帶凈電荷，相互排斥作用減弱，可能導致沉淀。毛細管等電聚焦（cIEF）是一種用于生成電荷同工型圖譜的分析技術，該圖譜是抗原和抗體獨特的 “指紋”。表征這些關鍵成分的等電點和電荷同工型圖譜，對于在測定開發過程中選擇合適的緩沖液 [33]，以及維持試劑的穩定性和一致性至關重要。為此，建議確定至少 10 個批次的每種抗原和抗體的等電點范圍，驗收標準包括新批次的 IEF 圖譜與參考圖譜的相似性，以及在從 10 個批次中確定的特定等電點范圍內。
3.2.3 抗原和抗體的準確定量
蛋白質定量方法多樣，如紫外分光光度法（UV 280）、福林 - 酚法（Lowry 法）、二辛可寧酸法（BCA）和布拉德福德法 [34] 等。這些方法原理不同，各有優缺點。UV280 法通過基于氨基酸序列計算摩爾消光系數來進行蛋白質定量 [35]，但容易受到微量核酸等紫外吸收雜質的干擾，導致蛋白質濃度測定不準確 [36]。為確保蛋白質定量準確，建議對每批抗原、酶、抗體和結合物采用多種方法（如 UV280 和 BCA 法）進行定量。此外，有必要為每種蛋白質建立單獨的定量校準品，這可避免單一方法引起的蛋白質定量誤差，確保同一產品不同批次間的一致性，從而使最終免疫測定的批次差異最小化且配方一致。
3.2.4 抗原和抗體的純度測定
毛細管電泳 - 十二烷基硫酸鈉（CE-SDS）是測定抗原和抗體純度的推薦方法，而比活性是評估酶相對純度的有用指標。此外，質譜（MS）和高效液相色譜（HPLC）有助于檢測污染蛋白、樣品蛋白水解和微小截斷 [34]。可采用兩種不同方法確認樣品的同一性：“自上而下” 質譜法通過檢測完整蛋白質的質量來識別純化過程中的任何降解；“自下而上” 質譜法則通過質譜指紋圖譜或胰蛋白酶消化來確認所使用的是正確的蛋白質，從而避免潛在錯誤（例如誤用了意外純化出的、分子量相近的宿主蛋白）[7]。
3.2.5 抗原和抗體的均一性測定
為確保試劑質量，評估其均一性至關重要。均一性指抗原和抗體的尺寸分布，與聚集物的存在密切相關。雖然多分散性不一定意味著不穩定性，但制劑中若檢測到大量聚集物，則表明蛋白質可能未處于最佳功能狀態。這可能導致實驗結果錯誤，例如在抗原 - 抗體相互作用研究中高估活性蛋白的濃度 [7]。可采用多種分析技術檢測均一性，包括尺寸排阻色譜 - 高效液相色譜（SEC-HPLC）、尺寸排阻色譜 - 多角度光散射（SEC-MALS）和動態光散射（DLS）[34]。其中，SEC-HPLC 是表征蛋白質樣品最常用的系統，可有效分離和檢測抗體的聚集物、片段和未配對鏈。通過測定單體相對于其他形式的相對豐度，該技術可提供有關蛋白質樣品組成的有價值信息。高均一性表明試劑穩定性良好，建議合格的抗原和抗體中單體含量至少占 95%。
3.2.6 最大化抗原和抗體的儲存穩定性
在蛋白質科學中，穩定性指蛋白質在特定儲存條件下在規定時間內維持其功能的能力。蛋白質的穩定性與批次一致性直接相關，且有助于減少變異性。大多數抗原和抗體的標準儲存溶劑是中性 PBS 緩沖液。然而，由于蛋白質的性質和等電點不同，它們可能通過多種途徑發生降解，包括聚合、變性、失活以及與包裝材料的相互作用 [37]。因此，有必要為每種抗原和抗體制定獨特的儲存緩沖液以確保最佳穩定性。為此，我們實驗室在 11 種不同緩沖液中評估了兩種雜交瘤抗體（PRO-C3 [38]、PRO-C6 [39]）和一種重組抗體（CTX-III [14]）的應激穩定性。值得注意的是，在 37°C 應激處理 14 天后，常規 pH 7.4 的 PBS 緩沖液并未為任何測試蛋白質提供最佳穩定性（圖 5）。
3.2.7 抗原和抗體的定向偶聯
抗原和抗體常與各種分子在隨機位點以隨機取向發生偶聯，這可能影響它們的免疫反應性，并在最終的體外診斷（IVD）試劑盒中引入相當大的批間差異（LTLV）。然而，將小分子藥物偶聯至抗體上特定糖基化位點的方法日益普及，這種方法可生成相對均一的抗體 - 藥物偶聯物制劑，且各批次的標記比例和位點等理化性質一致 [40,41]。這些定向偶聯方法也可用于抗原和抗體，以減少關鍵試劑的批間差異 [42,43]。
3.3 試劑盒質控品和質控盤
為減少免疫測定中的批間差異（LTLV），可采取多種措施，如向質控盤中添加蛋白酶抑制劑和防腐劑，或對整個盤進行凍干處理。據報道，抑肽酶 [25]、苯甲脒和 4 - 苯磺酰氟鹽酸鹽（AEBSF）[44] 是保護腦鈉肽（BNP）在樣品儲存過程中免受降解的有效蛋白酶抑制劑。使用與試劑盒校準品采用不同材料和工藝制備的定制對照品，可有效監測測定完整性和批間差異。第三方對照品的優勢在于其與測定試劑的生產相互獨立，能為質量控制提供額外保障。對照品應足夠靈敏，以檢測由試劑或試劑盒批次變化引起的偏差，從而在報告錯誤的患者結果之前采取糾正措施。
3.4 緩沖液和溶液制備參數的一致性
為確保免疫測定的重現性，不同批次制備時必須保持攪拌速度、時間和溫度的一致性。由于某些緩沖液的粘度和 pH 值會隨溫度變化，建議所有批次采用相同的制備條件。應對溫度、電導率、280nm 吸光度（OD280）、pH 值以及滲透壓（對于基于血清的試劑盒質控品和校準品）等理化參數進行過程中測試，以確保緩沖液混合充分。應避免過度混合，以防對抗原和抗體溶液造成機械剪切損傷。為制定可接受的規格標準，建議記錄至少三個批次的理化參數，并以其平均值作為參考。
Lot-to-Lot Variance in Immunoassays—Causes, Consequences,and Solutions
Yunyun Luo, Diagnostics 2023
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